Ele é mais conhecido por seu trabalho na melhoria do microscópio e por suas contribuições para o estabelecimento da microbiologia. A primeira observação de Leeuwenhoek, através de um microscópio rudimentar, o material branco raspado dos seus dentes. Para seu espanto, ele viu ”animálculos vivos muito pequenos, lindamente em movimento”, disse. Usando seus microscópios rudimentares foi o primeiro a observar e descrever organismos unicelulares. Quando fez essa observação o povo não tinha idéia do grande significado dela. Hoje esses animálculos são chamados de microorganismos. Ao final do século XVII, identificou, pela primeira vez, a levedura, parte integrante da produção de bebidas fermentadas, como um ser vivo.
O microscópio utilizado por Leeuwenhoek, para as suas descobertas, era constituído por uma lente biconvexa que tinha a capacidade de aumentar a imagem cerca de 200 vezes. Possuía a maior coleção de lentes do mundo. Ao todo, mais de 400 lentes de aumento e cerca de 250 microscópios. Desenhou e reconstruiu o deslocamento dos procariontes que viviam nas suas próprias lentes. Foi com esse modelo que descreveu o espermatozóide de insetos, cães e humanos; fibras musculares; glóbulos vermelhos; capilares sanguíneos; protozoários; rotíferos e o parasita intestinal Giardia lamblia, isolado de suas próprias fezes. Além disso, com as suas observações, contribuiu para a biologia celular descrevendo a estrutura celular dos vegetais, cujas células chamou de “glóbulos”. Contribuiu, também com a embriologia quando realizou os primeiros estudos descritivos da embriologia de alguns animais marinhos e conseguiu provar que até os seres mais simples se reproduzem.
Depois de desenvolver o seu método para a criação de lentes poderosas e aplicá-las para estudar do mundo microscópico, Van Leeuwenhoek foi introduzido, através de correspondência, para a Royal Society de Londres pelo famoso médico holandês Reinier de Graaf. Ele logo começou a enviar cópias de seus trabalhos em microscópia para a Royal Society. Em 1673, suas primeiras observações foram publicados pela Royal Society em seu diário: Philosophical Transactions. Entre os que foram publicados contas Van Leeuwenhoek de peças bucais de abelhas e picadas.
Apesar do sucesso inicial do relacionamento Van Leeuwenhoek com a Royal Society, esta relação foi logo posta à prova. Em 1676, sua credibilidade foi questionada quando ele enviou à Royal Society uma cópia de suas primeiras observações de microscópicos organismos unicelulares. Anteriormente, a existência de organismos unicelulares era totalmente desconhecido. Assim, mesmo com a sua reputação estabelecida com a Royal Society como um observador de confiança, suas observações da vida microscópica foram inicialmente recebida com ceticismo. Eventualmente, em face da insistência de Van Leeuwenhoek, a Royal Society enviou, a Delf, um vigário Inglês, bem como uma equipe de juristas respeitados e médicos para determinar a veracidade da capacidade dele. Além do mais, a Royal Society encarregou Robert Hooke e Nehemiah Grew a fim de construírem o melhor microscópio que pudessem para confirmar se Antonie não estava trapaceando – e não estava. Finalmente, em 1680, as observações de Van Leeuwenhoek foram plenamente justificadaas pela Sociedade.
Van Leeuwenhoek nunca escreveu nenhum livro, embora tenha escrito muitas cartas para a Royal Society. Em rezão disso, passaram-se 200 anos até que a microbiologia fosse iniciada formalmente.